抗菌肽
抗菌肽又稱抗微生物肽或宿主防御肽,是生物體經(jīng)誘導(dǎo)產(chǎn)生的具有廣譜抗菌活性和免疫調(diào)節(jié)活性的一類小分子多肽,屬于機體非特異性防御系統(tǒng)的固有組成部分,幾乎存在于所有生命形式中。抗菌肽通常由12-50個氨基酸組成,相對分子質(zhì)量一般在2-5 kDa左右。研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽具有快速殺菌和廣譜抗菌活性，包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、多重耐藥細(xì)菌、真菌、寄生蟲、包膜病毒和腫瘤細(xì)胞，并能在先天免疫和獲得性免疫之前起到橋梁作用，通過啟動獲得性免疫系統(tǒng)提高機體抵抗微生態(tài)感染的能力。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)超過3000種抗菌肽。
基于全球無抗政策的推動，抗菌肽無殘留、無耐藥性、無配伍禁忌、無停藥期，無毒安全等優(yōu)勢，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究最熱點之一。目前抗菌肽的生產(chǎn)方式主要有三種：天然提取、化學(xué)合成和生物工程發(fā)酵。天然抗菌肽主要來自動植物，含量極低，提取過程甚為復(fù)雜;化學(xué)合成方法高昂，每公斤成本上千萬人民幣，不適合工業(yè)化生產(chǎn)，無法廣泛普及應(yīng)用。生物工程發(fā)酵是利用發(fā)酵技術(shù)實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)，具備質(zhì)量穩(wěn)定、成本低等優(yōu)勢，是業(yè)界公認(rèn)的規(guī)模化生產(chǎn)的最佳途徑。但商品化抗菌肽開發(fā)并非一蹴而就，有以下幾個難點。
01
抗菌肽的生物學(xué)活性
目前學(xué)術(shù)界對抗菌肽的抗菌機制的認(rèn)識主要有以下兩種觀點，其一是抗菌肽作用于細(xì)胞膜。抗菌肽物理作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜上，使細(xì)胞膜穿孔并溢出細(xì)胞質(zhì)，從而達(dá)到殺死細(xì)菌。抗菌肽具有疏水性和親水性的兩親性質(zhì)，因此抗菌肽帶正電荷的分子和細(xì)胞膜磷脂分子上的負(fù)電荷形成靜電吸附結(jié)合到膜上，然后疏水端將分子插入膜中，從而使整個分子被吸入質(zhì)膜，這就破壞了蛋白質(zhì)和脂質(zhì)在質(zhì)膜上的原始排列，形成跨膜離子通道，大量離子丟失，細(xì)菌無法維持所需的胞內(nèi)滲透壓而死亡。抗菌肽殺菌第二種觀點是與細(xì)菌胞內(nèi)的靶點結(jié)合，從而達(dá)到抑制或殺滅細(xì)菌的作用。抗菌肽可以直接作用細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵的生物合成過程，例如抑制DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成，抑制細(xì)胞壁的合成，改變細(xì)胞質(zhì)膜通透性，抑制合成酶的活性和激活菌體自溶等，如腸桿菌肽抑制細(xì)菌的RNA聚合酶。也有一些抗菌肽可以通過影響多個生物合成過程來起到多渠道殺滅細(xì)菌。
在篩選抗菌肽的前期研發(fā)，首先需要研究抗菌譜，即抗菌作用的面是否廣泛，是否和現(xiàn)有臨床疾病相對應(yīng)，其次還需要研究抗菌強度，一般用最小抑菌濃度(MIC)來表示，例如一個抗菌肽對某一個病原菌有抗菌活性，但MIC值太高，即需要使用超大劑量才能達(dá)到有效性，這樣的產(chǎn)品也是沒有價值的。如腸桿菌肽對大腸桿菌的MIC<0.5ug/mL，對沙門氏菌MIC<0.1ug/mL，抗菌效果好的產(chǎn)品開發(fā)才會有市場價值。
02
抗菌肽的穩(wěn)定性
抗菌肽產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的另一個問題就是大部分抗菌肽穩(wěn)定還不夠理想，因為抗菌肽作為多肽類物質(zhì)，耐高溫、耐酸堿性能不是特別強。
抗菌肽屬于生物活性多肽，在生物發(fā)酵過程中宿主菌大都會產(chǎn)生很多蛋白酶，這些蛋白酶對多肽有降解的活性，這樣就會造成生產(chǎn)出來的抗菌肽在發(fā)酵過程中就被降解損耗掉，失去生產(chǎn)價值。在生產(chǎn)過程中，抗菌肽物料還需要由液體經(jīng)過加工變?yōu)楣腆w，這些過程都需要熱源，如果一個抗菌肽不耐熱，一樣失去生產(chǎn)價值。
同時我們開發(fā)抗菌肽的作用最重要的一個使用途徑是經(jīng)口給藥，抗菌肽有可能被消化道內(nèi)的胃蛋白酶、胰蛋白酶、膽汁酸等物質(zhì)會降解，導(dǎo)致無法發(fā)揮其生物學(xué)活性。對于口服給藥的多肽類產(chǎn)品來說，難度是非常大的。
多肽物質(zhì)，結(jié)構(gòu)決定性質(zhì)。如腸桿菌肽為鎖套肽，其中N端的8個氨基酸形成一個圓形的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，9-21個氨基酸形成尾巴，貫穿圓環(huán)，故其性質(zhì)超級穩(wěn)定，對高溫、酸、堿、胃蛋白酶、胰蛋白酶有良好的抵抗力。枯草菌肽有兩個二硫鍵，這些空間結(jié)構(gòu)決定了性質(zhì)的穩(wěn)定性。當(dāng)然有些抗菌肽本身不穩(wěn)定，科研工作者為了解決這個問題，提出很多方案以防止抗菌肽在體內(nèi)被降解，如：分別對肽鏈的氨基端和羧基端進(jìn)行乙酰化和酰胺化修飾、將線性肽鏈進(jìn)行首尾環(huán)化處理以提高穩(wěn)定性、形成聚乙二醇肽增強抗水解酶能力、脂質(zhì)體包裹抗菌肽使其緩慢釋放等方案。這些方案一定程度上緩解了抗菌肽的降低，但是帶來的副作用就是產(chǎn)量降低，影響活性、工藝更加復(fù)雜，大大提高了抗菌肽的生產(chǎn)成本。
03
抗菌肽的生產(chǎn)效率
抗菌肽具有廣闊的應(yīng)用前景，但是在制藥、食品、畜牧業(yè)等行業(yè)中大規(guī)模應(yīng)用的主要問題就是生產(chǎn)成本太高。抗菌肽大規(guī)模生產(chǎn)的主要限制條件之一就是成本問題，因此生產(chǎn)效率的高低直接決定是否可以大規(guī)模應(yīng)用，特別是在農(nóng)牧等對成本要求苛刻的領(lǐng)域。
前文分析，天然提取和化學(xué)合成都不適合抗菌肽的產(chǎn)業(yè)化，生物工程發(fā)酵時唯一可行方法，但也有很多難點。目前文獻(xiàn)報道的抗菌肽生產(chǎn)水平只有1-150mg /L ，如Chen等學(xué)者利用SUMo融合表達(dá)技術(shù)在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)了抗菌肽 Cecropin AD，搖瓶發(fā)酵液中產(chǎn)量為30.6mg/L；Bi等在大腸桿菌BL21中成功融合表達(dá)了雜合肽LfcinB-Melittin，通過檢測發(fā)酵液的含量為35mg/L;另有學(xué)者Cao使用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了雞的防御素Avian β-defensin6，發(fā)酵液中含量達(dá)到了114.9mg/L。我國科研人員在抗菌肽生產(chǎn)水平上實現(xiàn)了巨大突破，據(jù)報道農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼用抗生素替代技術(shù)重點實驗研究的抗菌肽發(fā)酵水平是文獻(xiàn)報道的100倍左右。
04
抗菌肽的純化工藝
抗菌肽純品的獲取很難。抗菌肽的分離純化是獲取過程中的一項關(guān)鍵環(huán)節(jié)，不管是天然的抗菌肽，還是基因工程技術(shù)獲得的抗菌肽，抗菌肽在分離純化基質(zhì)中的占比都很小，存在大量的雜蛋白及其他物質(zhì)，對于成分未知或者結(jié)構(gòu)復(fù)雜的抗菌肽就難度更大。所以，分離純化抗菌肽的關(guān)鍵在于不僅要得到單一的多肽，而且要保證獲取多肽的生物學(xué)活性，這是進(jìn)行下一步科學(xué)研究的基礎(chǔ)。抗菌肽是一類小分子多肽，不同多肽的氨基酸序列及空間結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致其在物理、化學(xué)、生物學(xué)等性質(zhì)上存在差異，利用待分離多肽與其它蛋白質(zhì)性質(zhì)上的差異，即可以設(shè)計出一套合理的多肽純化方案。在發(fā)酵液中，抗菌肽的占比不到1%，如果去掉99%的雜質(zhì)，獲得純度大于99.6%的抗菌肽單體是一項艱巨的科研工程。
05
建立抗菌肽檢測質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)
關(guān)于抗菌肽的評價方法有兩大類，一類是檢測抗菌肽的抗菌活性；主要使用擴(kuò)散法測定。原理是不同濃度的抗菌肽與作用于培養(yǎng)基中的菌種，抗菌肽殺死細(xì)菌從而會形成大小不同的抑菌圈，根據(jù)圈的大小，就可判定出抗菌肽的抗菌活性。同樣，一般在0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙褐屑尤氩煌瑵舛鹊目咕模咕臅煌潭鹊挠绊懢鷳乙旱纳L，根據(jù)吸光度的高低，可以判斷抗菌活性的強弱。抗菌活性檢測方法最大的問題是無法區(qū)分微生物發(fā)酵液中其他組分對抑菌結(jié)果的影響，如發(fā)酵液的培養(yǎng)基、pH等都會有一定的抑菌活性。更有甚者，在產(chǎn)品中加入其它抑菌物質(zhì)冒充抗菌肽。這種抗菌活性檢測方法操作簡單，人員設(shè)備要求低，是目前大多數(shù)抗菌肽研究所采用的方法，但不能確定產(chǎn)品中是否真實含有抗菌肽，只能表明該產(chǎn)品由抑菌活性。在抗菌肽的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立過程中，該方法只能作為輔助使用。
另一類是定性定量檢測方法，一般用的是高效液相色譜法和毛細(xì)管電泳。毛細(xì)管電泳設(shè)備投資大，一般研究單位使用較少。HPLC對混合物中復(fù)雜組分的分離能力強，也可以與其他技術(shù)聯(lián)合使用對物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確的定性、定量分析。不同理化性質(zhì)的抗菌肽可以用不同分離原理的色譜進(jìn)行分離，如極性大的抗菌肽可以用親水色譜進(jìn)行分離，不同電荷的抗菌肽可以用離子交換色譜分離，但科研工作中最常用的還是反向高效液相色譜法，也是學(xué)術(shù)界公認(rèn)的多肽類物質(zhì)檢測最科學(xué)的方法。如李波研究了高效分泌天蠶素的枯草芽孢桿菌宿主菌的中試發(fā)酵工藝，用反向高效液相色譜法檢測天蠶素含量達(dá)到961.52μg/m L。
06
研發(fā)投入成本高
抗菌肽屬于多肽類生物藥，一種新藥從最初發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物到最終上市，需要經(jīng)歷漫長過程。前瞻產(chǎn)業(yè)研究院報告顯示，國際上一種新藥的成本已經(jīng)超過10億美元，研發(fā)周期超過10年。但與發(fā)達(dá)國家相比，我國創(chuàng)新藥物研發(fā)仍處于劣勢，無論是研發(fā)投入能力還是產(chǎn)出方面與發(fā)達(dá)國家均有一定差距。新藥研發(fā)資金需求高、投入時間長，需要政策與資本的雙重支持。
綜上所述，抗菌肽產(chǎn)品的開發(fā)困難重重，需要廣大科研工作者攻堅克難。隨著抗菌肽研究的不斷深入以及生物技術(shù)的發(fā)展，希望未來有更多、更好的抗菌肽產(chǎn)品能夠產(chǎn)業(yè)化，從而能夠促進(jìn)整個醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展。
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